PCR法DNA探針標(biāo)記試劑盒操作使用說明書

【資料簡介】

原理及特點(diǎn)    PCR標(biāo)記的原理是用帶標(biāo)記的dNTP進(jìn)行PCR，zui后得到的PCR產(chǎn)物將帶有標(biāo)記，可以直接用于雜交試驗(yàn)。其原理示意圖如下：
PCR法制備DNA探針示意圖
 
本產(chǎn)品是在上述原理的基礎(chǔ)上開發(fā)，它具有下列特點(diǎn)：
1.    一站式，本試劑盒提供經(jīng)過優(yōu)化的試劑，不需要用戶自己摸索。
2.    足夠10次50 uL體系的常規(guī)PCR（用于制備標(biāo)記反應(yīng)的模板和設(shè)置對照反應(yīng)）和5次50 uL體系的標(biāo)記反應(yīng)。
3.    一次標(biāo)記可以得到ug級的雙鏈DNA探針或約700ng的單鏈DNA探針，足夠多次雜交實(shí)驗(yàn)用。
4.    既可用于制備雙鏈探針，也可以用于單鏈探針。
5.    90604A需自備含標(biāo)記核苷酸的dNTP， 90604B和90604C分別含*和地高辛標(biāo)記的底物。自備的標(biāo)記包括fluorescein-dUTP、hydroxycoumarin-dUTP、resorufin-dUTP和aminoallyl-dUTP等。
6.    本產(chǎn)品得到的探針參入率一般為4-5%（每100個核苷酸中有4-5個將帶有非同位素標(biāo)記），有效降低了空間阻礙，檢測效果*。
7.    可以用于Southern 和Northern Blot、原位雜交、菌落和斑點(diǎn)印跡雜交等分析。
規(guī)格及成分    成 份    編 號    5次塑料盒包裝
2×標(biāo)記PCR Mix    90604A    500 uL
dNTP，2 mM each    121128    50 uL
含Biotin-11-dUTP的 dNTP     90604B    25 uL（僅B有）
含DIG-11-dUTP的dNTP    90604C    25 uL（僅C有）
超純水    100935    1 mL
使用手冊    1份
注：標(biāo)記PCR Mix不含dNTP。
運(yùn)輸及保存    低溫運(yùn)輸，-20℃保存，有效期一年
自備試劑    DNA模板和模板專一性引物。
使用方法    一：準(zhǔn)備工作
1.    按常規(guī)的方法設(shè)計PCR引物，使探針長度在400-800bp之間。過短則標(biāo)記參入少，探針雜交信號強(qiáng)度減弱；過長則非特異雜交增加，背景變強(qiáng)。
2.    根據(jù)PCR引物優(yōu)化PCR條件。
3.    由于標(biāo)記的dNTP比較珍貴，所以本試劑盒不推薦以基因組DNA或其他復(fù)雜DNA為模板直接進(jìn)行PCR標(biāo)記，而是建議采取下述的兩步法標(biāo)記來提高成功率，即先制備非標(biāo)記PCR產(chǎn)物，再以之為模板制備標(biāo)記的PCR產(chǎn)物。
二：非標(biāo)記PCR產(chǎn)物的制備
4.    設(shè)置50 uL PCR的反應(yīng)體系：
成份    用量
2×標(biāo)記PCR Mix    25 uL
dNTP，2mM each    5 uL
自備的探針引物一（10pmol/uL）    1 uL（10 uM）
自備的探針引物二（10pmol/uL）    1 uL（10 uM）
自備的模板DNA    1 ug基因組DNA或1ng質(zhì)粒DNA
超純水    補(bǔ)到50 uL
5.    按已經(jīng)優(yōu)化的PCR參數(shù)進(jìn)行PCR。
6.    電泳檢測和膠回收所需的PCR產(chǎn)物，并定量。用10 pmol引物一般能得到1ug左右的PCR產(chǎn)物（具體取決于PCR產(chǎn)物的長度）。注意：采取膠回收而不是PCR回收以避免殘留引物干擾后續(xù)的標(biāo)記PCR。
三：標(biāo)記PCR反應(yīng)（做一個不加標(biāo)記的對照用于定量）
說明：在設(shè)置下面反應(yīng)時，如果加一種引物，就得到單鏈標(biāo)記的PCR產(chǎn)物；如果加兩種引物，則得到雙鏈標(biāo)記的PCR產(chǎn)物。由于雙鏈PCR探針在雜交前雖然要變性成單鏈后使用，但雜交時變性的雙鏈彼此還會復(fù)性，這種復(fù)性會與探針-靶DNA雜交反應(yīng)相競爭，降低雜交效率，因此強(qiáng)烈推薦使用單鏈標(biāo)記的DNA探針。
成份    樣品    對照
2×標(biāo)記PCR Mix    25 uL    25 uL
含Biotin-11-dUTP的 dNTP或
含DIG-11-dUTP的dNTP或
自備的含其他標(biāo)記dUTP的dNTP    5 uL    不加
dNTP，2mM    不加    5 uL
雙鏈標(biāo)記：探針引物一和引物二
單鏈標(biāo)記：探針引物一或引物二    每種50 pmol
一種50 pmol    每種50 pmol
一種50 pmol
上步膠純化所得PCR產(chǎn)物
（單鏈標(biāo)記可用100ng）    10 ng    10 ng
超純水    補(bǔ)到50 uL    補(bǔ)到50 uL
注意：本試劑盒提供的dNTP混合物中，標(biāo)記底物與非標(biāo)記底物的比例已經(jīng)進(jìn)過優(yōu)化，如果自備標(biāo)記dUTP，其與dTTP的*比例需要優(yōu)化，標(biāo)記不同，比例不同。對DIG-11-dUTP，*比例1：3；對BrdUTP，*比例為1：1。
7.    按第5步的PCR參數(shù)進(jìn)行標(biāo)記PCR，但需要進(jìn)行下列修改：一是循環(huán)數(shù)增加到35-55個循環(huán)。由于模板為純化后的PCR產(chǎn)物，探針對擴(kuò)增長度完整性要求不高（長度不均的探針由于能形成網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)，效果反而更好），所以可以增加循環(huán)數(shù)；二是延伸時間增加15秒，因?yàn)闃?biāo)記dUTP參入到DNA的速度比常規(guī)的dTTP慢；三是降低復(fù)性溫度5-7℃，因?yàn)闃?biāo)記核苷酸參入到DNA后，新模板的Tm值將降低。
8.    標(biāo)記探針的定量：取標(biāo)記反應(yīng)和對照反應(yīng)的產(chǎn)物1-5 uL，在瓊脂糖凝膠上跟濃度已知的DNA marker一起電泳，并判斷探針的濃度。由于標(biāo)記反應(yīng)的PCR產(chǎn)物中額外帶有非同位素的配體（*，地高辛等）、因此其泳動速度將慢于非標(biāo)記PCR產(chǎn)物（但同位素標(biāo)記不能用此法）。是下圖是一個典型的雙鏈PCR產(chǎn)物電泳結(jié)果圖：
 
標(biāo)記的DNA（右）與未標(biāo)記的DNA（左）電泳比較
注意：如果擴(kuò)增的是單鏈DNA探針，其結(jié)合EB的能力遠(yuǎn)低于雙鏈DNA（EB是嵌合到雙鏈堿基對之間的，而單鏈DNA沒有堿基對，只有一些局部區(qū)域折疊形成的有限雙鏈區(qū)，因此能結(jié)合的EB很少），因此EB染色的強(qiáng)弱不能準(zhǔn)確反應(yīng)DNA的濃度，可以采用銀染定量（跟marker比較）。一般100ng模板按上述條件經(jīng)過單鏈PCR擴(kuò)增可得到700ng左右探針。
9.    剩余的PCR標(biāo)記產(chǎn)物可以不經(jīng)過純化，直接加入（對單鏈PCR探針）雜或加熱變性并急冷后加入（對雙鏈PCR探針）到雜交液中使用。如果暫時不用請放-20℃長期保存。如果需要純化，請使用乙酸銨/乙醇沉淀法。
關(guān)聯(lián)產(chǎn)品    柱式Sephadex核酸探針純化試劑盒