總抗氧化能力檢測試劑盒（ABTS法）

【資料簡介】

使用說明：

1. ABTS工作液的配制：

   (1) 參考下表，根據待測定樣品的數量(含標準曲線)配制適量的ABTS工作液：

待測定樣品數	約20-30個	約50-75個	約100-150個	約200-300個
ABTS溶液	40微升	100微升	200微升	400微升
氧化劑溶液	40微升	100微升	200微升	400微升
ABTS工作母液	80微升	200微升	400微升	800微升

      ABTS工作母液配制后，室溫避光存放12-16小時后方可使用。配制好的ABTS工作母液室溫避光存

      放，在2-3天內穩定。

      在使用前，把ABTS工作母液用PBS或80%乙醇稀釋成ABTS工作液，要求ABTS工作液的吸光度減去相

      應的PBS或80%乙醇空白對照后，A734為0.7±0.05。當待檢測樣品為水溶性樣品時，用PBS稀釋，

      此時ABTS工作母液的稀釋倍數約為90-100倍；當待檢測樣品為非水溶性樣品時，用80%乙醇稀釋，

      此時ABTS工作母液的稀釋倍數約為100-110倍。

2. 待測樣品的準備：

   (1) 血清、血漿、唾液或尿液樣品的準備：

       血清、血漿、唾液或尿液樣品每個樣品需要10微升，都可以直接用于測定。血清、血漿、唾液或

       尿液樣品都可以使用新鮮樣品進行測定，也可以-80℃凍存后再進行測定。-80℃凍存的樣品至少

       在一個月內所測定獲得的數據沒有顯著變化。注意：血漿制備時可以使用肝素或檸檬酸鈉抗

       凝，不宜使用EDTA抗凝。根據文獻報道，人血清或血漿中的總抗氧化能力為0.5-2mM，人唾液中

       的總抗氧化能力為0.3-1mM，人尿液中的總抗氧化能力為0.2-3mM。

   (2) 細胞或組織樣品的準備：

       對于細胞樣品，收集約100萬個細胞(不必計數，直接刮下，不宜使用胰酶和EDTA消化)，放

       置在200微升冰冷的PBS或HBSS溶液中，勻漿或超聲以充分破碎細胞并釋放其中的抗氧化物，4℃ 

       約12000g離心5分鐘，取上清用于后續測定。對于組織樣品，每20mg組織加入100微升冰冷的PBS

       或HBSS溶液，勻漿或超聲以充分破碎組織并釋放其中的抗氧化物，4℃ 約12000g離心5分鐘，取

       上清用于后續測定。以上所有操作均需在4℃或冰上操作。制備好的細胞或組織樣品的上清如果

       不立即用于測定，可以在-80℃凍存。-80℃凍存的樣品至少在一個月內所測定獲得的數據沒有顯

       著變化。細胞或組織樣品在測定總抗氧化能力時需同時測定蛋白濃度，zui后測定獲得的總抗氧化

       能力通常表示為每毫克或每克蛋白重量中的總抗氧化能力，表示單位為mmol/mg或mmol/g。

   (3) 其它樣品的準備：

       植物或中草藥抽提液都可以直接用于檢測。需注意樣品本身的顏色不會干擾檢測。植物或中草藥

       抽提液的抗氧化能力可以表示為每毫克或每克抽提物干重中的總抗氧化能力，表示單位為

       mmol/mg或mmol/g。各種抗氧化物測定其抗氧化能力時，通常配制成0.15-1.5mM，然后進行測

       定。抗氧化物的濃度可以以摩爾濃度表示時，測定獲得的總抗氧化能力可以用相對總抗氧化能力

       進行表示，例如0.5mM的某抗氧化物其測定獲得的OD值和1mM的Trolox測定獲得的OD值相同，則其

       相對總抗氧化能力為2，再如0.2mM的某抗氧化物其測定獲得的OD值和1mM的Trolox測定獲得的OD

       值相同，則其相對總抗氧化能力為5。根據文獻報道和實際測定結果，維生素C的抗氧化能力為

       1.0，維生素E的抗氧化能力為1.0，GSH的抗氧化能力為1.3，Uric acid的抗氧化能力為1.0，

       β-Carotene的抗氧化能力為2.6，Lycopene的抗氧化能力為3.1，Quercetin的抗氧化能力為

       3.0，鮮橙汁的總抗氧化能力為2.2。

3. 標準曲線測定的準備：

        用蒸餾水或樣品配制溶液稀釋標準品。對于血清、血漿、唾液或尿液樣品直接用蒸餾水或

        PBS稀釋標準品，對于細胞或組織樣品，用用于細胞或組織勻漿的溶液稀釋標準品，其它樣

       品則用樣品配制溶液對標準品進行稀釋，或選擇PBS或80%乙醇來稀釋標準品。把10mM Trolox

        標準溶液稀釋成0.15、0.3、0.6、0.9、1.2和1.5mM。

4. 總抗氧化能力的測定：

   (1) 96孔板的每個檢測孔中加入200微升ABTS工作液。

   (2) 空白對照孔中加入10微升蒸餾水或PBS等適當溶液；標準曲線檢測孔內加入10微升各種濃度的

       Trolox標準溶液；樣品檢測孔內加入10微升各種樣品。輕輕混勻。

   (3) 室溫孵育2-6分鐘后測定A734。如果測定A734有困難，也可以在725-745nm范圍內進行測定。

   (4) 根據標準曲線計算出樣品的總抗氧化能力。如果樣品測定出來的吸光度在標準曲線范圍以外，

       需把樣品適當稀釋或濃縮后再進行測定。

   (5) 總抗氧化能力的表示方式：

       在采用Trolox作為標準品進行總抗氧化能力檢測時，樣品的抗氧化能力可以用Trolox-

       Equivalent Antioxidant Capacity (TEAC)來表示。對于混合物例如血漿、血清、唾液或尿

       液等的抗氧化能力，可以直接用Trolox的摩爾濃度來表示，例如某樣品測定獲得的抑制率和

       0.6mM的Trolox相同，則該樣品的總抗氧化能力為0.6mM；再如某樣品稀釋5倍后測定獲得的抑

       制率和0.5mM的Trolox相同，則該樣品的總抗氧化能力為2.5mM。對于細胞或組織裂解液等，例

       如某裂解液樣品的蛋白濃度為0.15mg/ml，測定獲得的抑制率和0.3mM Trolox相同，則該裂解液

       樣品的總抗氧化能力為0.3mM/0.15mg/ml，即為2mmol/g。對于植物或中草藥抽提物，例如某樣

       品的濃度為0.1mg/ml，測定獲得的抑制率和0.5mM Trolox相同，則該樣品的總抗氧化能力為

       0.5mM/0.1mg/ml，即為5mmol/g。對于純的化合物例如維生素C、GSH等，例如使用1mM某樣品檢

       測時的抑制率相當于1.5mM Trolox時，該樣品的抗氧化能力為1.5mM，再如使用0.5mM某樣品檢

       測的抑制率相當于0.8mM Trolox時，該樣品的抗氧化能力為1.6mM。