細胞培養經驗

【資料簡介】

培養基

1、關于培養基，如果不是買液體的，那么其ph問題一定要給予充分重視！配置過程中的調解我就不說了，能用ph計！

2、關于培養基的保存，如果你有輸液瓶，那么我建議你每一次打開以后，還是換一個膠塞。如果象我一樣就是普通培養瓶，那么記得一定要用封口膜封口，不要擔心封口膜會帶來更多的污染！你可以先將封口膜在使用前開紫外時略微照一下！但是保存封口膜找一個密封的瓶子等，比如吃完糖的罐子。

3、培養基中還是加好所需血清保存，這樣使用比較方便。當然不是所有的培養基，而是2周左右可以使用完的量啊！

傳代：

1、細胞傳代的時候量要做到zui少但是有效果就可以，這樣對細胞的傷害時zui小的。我一般加入的量恰好將將夠鋪滿整個瓶底。另外消化完成也就是晃動瓶子時有沙粒狀大片脫落，需馬上加入含有血清的培養基中止消化！有人這樣直接傳代，我認為效果不是很好，因為這時血清被用來種子且瓶中還有損傷的細胞，所以我還是一貫主張離心完在傳代。

2、既然說到了離心，那么一定要平衡你的培養瓶。關于離心機平衡的重要性我應用下面這個帖子吧。原載于 散人筆記 原文地址 http://www.eryi.org/blog/post/centrifuge-rpm-to-rcf.html

3、離心完以后去掉舊的培養基，加入新鮮培養基（含血清）。然后用滴管一定要吹打均勻在傳代！！！我在培養HEPG2此種細胞不易消化且不易分散，但是成團對其影響很大。

4、首先要充分判斷傳代的時機了，一般來說至少長到80％左右（我一直在培養腫瘤細胞）。我一般是2～3天就能傳了。記住細胞可以*張滿瓶底甚至已經重疊在傳，但是不要還沒有長到一定的規模就傳代！這樣很容易損傷細胞，當然不同的細胞不好用時間來限制，但是一定要顯微鏡下觀察好了在決定是否傳代。需要注意的是使用pbs先清洗一下細胞，以消除原來培養液種血清的干擾。

5、一般來說傳代前一天或者上午至少應該更換半量培養基，這樣可以保證傳代的細胞仍然保持旺盛的生命力，使其不會因傳代受到更大的損傷～

6、關于傳代是否使用，我想因細胞各異。如果使用，我建議的量一般是600ul左右，這個是指100ml玻璃培養瓶，腫瘤細胞而言，一般就是剛剛可以將瓶底覆蓋為好。量不要過大，以免對細胞損傷過大。

7、肉眼觀察在輕輕晃動培養瓶的時候發現細胞呈沙粒狀一片一片的滑落開始中止消化，我一般直接加入含有血清的培養基，然后滴管輕輕吹打混勻，轉移至玻璃離心管，800rpm，6分鐘左右。離心結束即可看見大量白色細胞聚集在離心管底部。

8、離心以后棄掉舊的培養基，換新培養基，然后吹打混勻。一般一瓶細胞數量是600萬左右，也就是6*106個，但是我平時傳代是不計數的，只有鋪板的時候才計的，但是憑經驗而言，一瓶傳2瓶是沒有任何問題的。這里需要指出的是，原來培養細胞的瓶子如果你操作得當還是可以繼續使用的。

9、一般而言傳代24h后換一下培養基。雖然細胞在4h左右基本可以*貼壁，但是我們還是需要讓他在這個初始環境下生長適應一下。

培養瓶的清洗和滅菌.

1、本人覺得尤其是新手，恐怕*關就是清洗培養用品了。一般而玻璃用品的辦法就是充分泡酸，就是硫酸和重鉻酸鉀一定比例的洗液。時間來的及就盡量多放一段時間，特別管用的。但是要記住將瓶子內部充滿洗液，并且充分接觸。

2、泡過洗液的瓶子等玻璃儀器，包括離心管和膠頭滴管等，這時候就要用自來水沖洗，直到沒有洗液殘留；接下來就是蒸餾水沖洗了，整個過程至少是5次吧，自己感覺就可以了，一定記得帶上橡膠手套啊～

3、洗干凈的瓶子等放入烘箱干燥，是帶有鼓風的烘箱，而不是真空的啊！這樣可以節省好多時間。

4、瓶子干了以后，用鋁箔或者牛皮紙扎緊瓶口，在鼓風烘箱中160-18度干法滅菌4h，這里的4h一般是指溫度升到160度左右開始的，而不是指放入烘箱哪一刻就開始計時。這里特別注意滅菌結束以后不要立刻打開烘箱門，以免質量差的瓶子突然接觸冷空氣而炸裂傷人。而是等到烘箱降溫到身體可以接受的溫度在將其拿入細胞室，這樣滅菌的瓶子至少可以使用10天的。當然一定將瓶口扎緊啊！！！

5、實驗中，也有人使用滅菌鍋滅菌玻璃瓶子等，這也能達到滅菌要求，但是高壓滅菌結束干燥的時候不是很容易！我使用干法滅菌。

6、這里需要指出的膠頭滴管的滅菌是，將其放入到不銹鋼杯中，一般很容易定做的。杯子下面放好用紗布包好的棉花，滴管上邊用棉花塞好，不要特別緊以免滴管不好用；也不能特別松，要不會將棉花吹落的。

7、玻璃離心管滅菌方法和培養瓶方法是一樣的，但是就是用飯盒或者別的器皿裝好離心管，這里的離心管也是包扎好瓶口的。

MTT實驗

1、大家應該明白這個實驗的原理（論壇里面很多，不重復.......），簡單一句話就是：只有活細胞才能與mtt反應，并且能夠產生有紫外吸收的晶體，也就是吸收度反應的是活細胞的相對數量，而不是數量！！！

2、做mtt的準備：應該先設計好實驗，比如藥物濃度，還有接種密度和接種體積，這2點相當重要。因為你設定的藥物濃度有可能不是你zui終的作用濃度（如果你不換液的話），并且需要注意接種密度太大，很可能讓你的實驗一塌糊涂；如果你的接種密度太低，也有可能產生假陽性，造成盲目的樂觀啊！還有就是給藥時間，這個你應該在充分掌握你自己細胞生長裝態的情況下確定，當然有條件的可以做個流式或者細胞生長曲線來定！

3、關于配藥，我主要想說的是極性小的藥物，也就是水溶性或者培養基基本不溶的樣品，那么需要加入有機溶劑，這時你就必須設定陰性對照，依據給藥組的有機溶劑zui大含量對陰性對照組給予相應的有機溶劑。舉個例子：假設1mg藥物溶解于500ulDMSO，然后稀釋到5ml，那么相應的陰性對照組DMSO的含量就應該是500ulDMSO/5ml。