夾心法ELISA檢測可溶性白介素2受體實驗方法

【資料簡介】

可溶性白細胞介素2受體SIL-2R存在于人的血清、尿液及腦脊液中，其濃度的高低與許多疾病的發生、發展、治療效果及預后有密切，如成人T淋巴細胞白血病(ATL)艾滋病、B細胞慢淋、毛細胞白血病，以及腎移植后發生急性排斥反應時或異基因骨髓移植發生移植物抗宿主時，患者血清中SIL-2R水平明顯升高。SIL-2R的檢測多采用酶聯免疫吸附技術，其中夾心法ELISA是一種較簡單的檢測方法，國外已廣泛應用于臨床及基礎免疫學研究。

㈠ 基本原理：

將抗Tac特異性單克隆抗體Ab1吸附于固相載體，識別細胞培養上清或血清等標本中Tac并與之結合。應用辣根過氧化物酶標記的識別另一種Tac表位的特異性單克隆抗體Ab2識別固定于固相載體的Tac并與之結合。通過酶催化底物顯色反映待檢標本中游離Tac的水平。

㈡ 操作步驟：

1. 刺激外周血單個核細胞(PBMC)：取外周血10ml，肝素抗凝，常規分離單個核細胞，加至24孔細胞培養板，2×106/孔，RPMI1640-10%FCS+PHA(3μg/ml，Wellcome公司，37℃、5%CO2培養72小時,收集上清，-20℃保存待測。同時設未加PHA對照組。犚2可選用病人血清為待測標本。

2. Ab1包被：用0.05MpH9.6碳酸鹽包被緩沖液將抗Tac特異性單克隆抗體(Ab1)犗!釋至5μg/ml，加至elisa板，100μl/孔，4℃包被72小時。

3. 封閉：1%BSA-PBS封閉，350μl/孔，37℃孵育2小時。

4. 加樣：ELISA板用PBS-T洗液洗3次，牻+PHA刺激單個核細胞培養上清及對照組上清或病人血清倍比稀釋至1∶1024，每一稀釋度取100μl加至ELISA板。犙!HUT-102B2細胞培養上清為陽性對照，RPMI1640-10%FCS培養液為陰性對照。37℃，孵育2小時，洗滌。

5. 加酶標抗體：于各反應孔加辣根過氧化物酶標記另一種抗 Tac 特異性單克隆抗體Ab2以效價滴定的*稀釋度稀釋)100μl。37℃孵育2小時，洗滌。

6. 加底物顯色：各反應孔加新鮮配制ABTS底物溶液100μl，37℃、孵育15分鐘。

7. 終止反應：各反應孔加2%氟化鈉終止液50μl。

8. 結果判定：首先肉眼觀察反應孔內顏色，稀釋梯度是否均勻。陽性、犚u性結果是否明顯。然后于ELISA檢測儀上測各孔O.D值(410nm)。

㈢ 試劑器材：

1. 試劑：包被緩沖液、洗滌液、稀釋液、終止液配制同常規ELISA方法。Tac特異性單克隆抗體、辣根過氧化物酶標記的Tac特異性單克隆抗體,HUT-102B2細胞培養上清,PHA。

2. 器材：聚苯乙烯塑料板，ELISA檢測儀，37℃水浴箱，4℃冰箱，CO2孵箱。可調加樣器。

㈣ 注意事項：

1. 包被抗體活性要較高，否則影響本實驗敏感性。

2. 經篩選比較，封閉液以1%BSA-PBS為好。

3. 酶標結合物應用前應進行效價滴定，選擇*工作濃度。

4. 底物應選用靈敏度較高的供氫體如ABTS等。

5. 如有條件，酶標McAb可由*-McAb和親和素-HRP系統代替，以增加實驗的敏感性。