紫外吸收法測(cè)蛋白質(zhì)含量

【資料簡(jiǎn)介】

蛋白質(zhì)分子中，、苯和殘基的苯環(huán)含有共軛雙鍵，使蛋白質(zhì)具有吸收紫外光的性質(zhì)。吸收高峰在280nm處，其吸光度（即光密度值）與蛋白質(zhì)含量成正比。此外，蛋白質(zhì)溶液在238nm的光吸收值與肽鍵含量成正比。利用一定波長(zhǎng)下，蛋白質(zhì)溶液的光吸收值與蛋白質(zhì)濃度的正比關(guān)系，可以進(jìn)行蛋白質(zhì)含量的測(cè)定。

紫外吸收法簡(jiǎn)便、靈敏、快速，不消耗樣品，測(cè)定后仍能回收使用。低濃度的鹽，例如生化制備中常用的（NH₄）2SO₄等和大多數(shù)緩沖液不干擾測(cè)定。特別適用于柱層析洗脫液的快速連續(xù)檢測(cè)，因?yàn)榇藭r(shí)只需測(cè)定蛋白質(zhì)濃度的變化，而不需知道其值。

此法的特點(diǎn)是測(cè)定蛋白質(zhì)含量的準(zhǔn)確度較差，干擾物質(zhì)多，在用標(biāo)準(zhǔn)曲線法測(cè)定蛋白質(zhì)含量時(shí)，對(duì)那些與標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)中和含量差異大的蛋白質(zhì)，有一定的誤差。故該法適于用測(cè)定與標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)氨基酸組成相似的蛋白質(zhì)。若樣品中含有嘌呤、嘧啶及核酸等吸收紫外光的物質(zhì)，會(huì)出現(xiàn)較大的干擾。核酸的干擾可以通過(guò)查校正表，再進(jìn)行計(jì)算的方法，加以適當(dāng)?shù)男Ｕ５且驗(yàn)椴煌牡鞍踪|(zhì)和核酸的紫外吸收是不相同的，雖然經(jīng)過(guò)校正，測(cè)定的結(jié)果還是存在一定的誤差。

此外，進(jìn)行紫外吸收法測(cè)定時(shí)，由于蛋白質(zhì)吸收高峰常因pH的改變而有變化，因此要注意溶液的pH值，測(cè)定樣品時(shí)的pH要與測(cè)定標(biāo)準(zhǔn)曲線的pH相一致。

1.280nm的光吸收法

因蛋白質(zhì)分子中的、苯和在280nm處具有zui大吸收，且各種蛋白質(zhì)的這三種氨基酸的含量差別不大，因此測(cè)定蛋白質(zhì)溶液在280nm處的吸光度值是zui常用的紫外吸收法。

測(cè)定時(shí)，將待測(cè)蛋白質(zhì)溶液倒入石英比色皿中，用配制蛋白質(zhì)溶液的溶劑（水或緩沖液）作空白對(duì)照，在紫外分光度計(jì)上直接讀取280nm的吸光度值A(chǔ)280。蛋白質(zhì)濃度可控制在0.1~1.0mg/ml左右。通常用1cm光徑的標(biāo)準(zhǔn)石英比色皿，盛有濃度為1mg/ml的蛋白質(zhì)溶液時(shí)，A280約為1.0左右。由此可立即計(jì)算出蛋白質(zhì)的大致濃度。

許多蛋白質(zhì)在一定濃度和一定波長(zhǎng)下的光吸收值（A1%1cm）有文獻(xiàn)數(shù)據(jù)可查，根據(jù)此光吸收值可以較準(zhǔn)確地計(jì)算蛋白質(zhì)濃度。下式列出了蛋白質(zhì)濃度與（A1%1cm）值（即蛋白質(zhì)溶液濃度為1%，光徑為1cm時(shí)的光吸收值）的關(guān)系。文獻(xiàn)值A(chǔ)1%1cm,λ稱(chēng)為百分吸收系數(shù)或比吸收系數(shù)。

蛋白質(zhì)濃度= (A280′10 )/ A1%1cm,280nm (mg/ml)

(Q 1%濃度?10mg/ml)

2.280nm和260nm的吸收差法

核酸對(duì)紫外光有很強(qiáng)的吸收，在280nm處的吸收比蛋白質(zhì)強(qiáng)10倍（每克），但核酸在260nm處的吸收更強(qiáng)，其吸收高峰在260nm附近。核酸260nm處的消光系數(shù)是280nm處的2倍，而蛋白質(zhì)則相反，280nm紫外吸收值大于260nm的吸收值。通常：

純蛋白質(zhì)的光吸收比值：A280/A260 ? 1.8

純核酸的光吸收比值： A280/A260 ? 0.5

含有核酸的蛋白質(zhì)溶液，可分別測(cè)定其A280和A260，由此吸收差值，用下面的經(jīng)驗(yàn)公式，即可算出蛋白質(zhì)的濃度。蛋白質(zhì)濃度=1.45×A280－0.74×A260 (mg/ml)

此經(jīng)驗(yàn)公式是通過(guò)一系列已知不同濃度比例的蛋白質(zhì)（酵母烯醇化酶）和核酸（酵母核酸）的混合液所測(cè)定的數(shù)據(jù)來(lái)建立的。

3.215nm與225nm的吸收差法

蛋白質(zhì)的稀溶液由于含量低而不能使用280nm的光吸收測(cè)定時(shí)，可用215nm與225nm吸收值之差，通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)曲線法來(lái)測(cè)定蛋白質(zhì)稀溶液的濃度。

用已知濃度的標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)，配制成20～100 mg/ml的一系列5.0ml的蛋白質(zhì)溶液，分別測(cè)定215nm和225nm的吸光度值，并計(jì)算出吸收差： 吸收差D= A215 －A225

以吸收差D為縱座標(biāo)，蛋白質(zhì)濃度為橫座標(biāo)，繪出標(biāo)準(zhǔn)曲線。再測(cè)出未知樣品的吸收差，即可由標(biāo)準(zhǔn)曲線上查出未知樣品的蛋白質(zhì)濃度。

本方法在蛋白質(zhì)濃度20~100mg/ml范圍內(nèi)，蛋白質(zhì)濃度與吸光度成正比，NaCl、（NH₄）2SO₄以及0.1M磷酸、硼酸和Tris等緩沖液，都無(wú)顯著干擾作用，但是0.1N NaOH,0.1M乙酸、琥珀酸、鄰苯二甲酸、等緩沖液的215nm光吸收值較大，必須將其濃度降到0.005M以下才無(wú)顯著影響。

4.肽鍵測(cè)定法

蛋白質(zhì)溶液在238nm處的光吸收的強(qiáng)弱，與肽鍵的多少成正比。因此可以用標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)溶液配制一系列50~500mg/ml已知濃度的5.0ml蛋白質(zhì)溶液，測(cè)定238nm的光吸收值A(chǔ)238，以A238為縱座標(biāo),蛋白質(zhì)含量為橫座標(biāo)，繪制出標(biāo)準(zhǔn)曲線。未知樣品的濃度即可由標(biāo)準(zhǔn)曲線求得。

進(jìn)行蛋白質(zhì)溶液的柱層析分離時(shí)，洗脫液也可以用238nm檢測(cè)蛋白質(zhì)的峰位。

本方法比280nm吸收法靈敏。但多種有機(jī)物，如醇、酮、醛、醚、有機(jī)酸、酰胺類(lèi)和過(guò)氧化物等都有干擾作用。所以用無(wú)機(jī)鹽，無(wú)機(jī)堿和水溶液進(jìn)行測(cè)定。若含有有機(jī)溶劑，可先將樣品蒸干，或用其他方法除去干擾物質(zhì)，然后用水、稀酸和稀堿溶解后再作測(cè)定。