己糖激酶（hexokinase，HK）試劑盒說明書

【資料簡介】

己糖激酶(hexokinase，HK)試劑盒說明書   
分光光度法  50 管/48 樣 
測定意義 
HK（EC 2.7.1.1）廣泛存在于動物、植物、微生物和培養細胞中，是葡萄糖分解過程中的第
一個關鍵酶，催化葡萄糖轉化為 6-磷酸葡萄糖，6-磷酸葡萄糖是糖酵解和磷酸戊糖途徑的交
叉點。 
測定原理 
HK 催化葡萄糖合成6-磷酸葡萄糖，6-磷酸葡萄糖脫氫酶進一步催化 6-磷酸葡萄糖脫氫生成
NADPH，NADPH 在 340nm有特征吸收峰。 
需自備的儀器和用品 
紫外分光光度計、恒溫水浴鍋、臺式離心機、可調式移液器、1 mL石英比色皿、研缽、冰
和蒸餾水。 
試劑的組成和配制 
提取液：60mL×1瓶，4℃保存；   
試劑一：液體30mL×1瓶，  4℃保存； 
試劑二：粉劑×1 瓶，4℃保存；臨用前加入 30mL蒸餾水充分溶解備用； 
試劑三：液體5 mL×1瓶，4℃保存； 
試劑四：粉劑×1 支，-20℃保存，臨用前加入 4mL蒸餾水充分溶解備用； 
試劑五：粉劑×1 支，-20℃保存；臨用前加入 2mL蒸餾水充分溶解備用； 
試劑六： 粉劑×1 支， -20℃保存； 臨用前加入 250μL試劑一和 250μL蒸餾水充分溶解備用；  
樣本的前處理 
1、細菌或培養細胞：先收集細菌或細胞到離心管內，離心后棄上清；按照細菌或細胞數量
（104
個）：提取液體積（mL）為 500~1000：1 的比例（建議 500萬細菌或細胞加入 1mL提
取液） ，超聲波破碎細菌或細胞（冰浴，功率20％或200W，超聲 3s，間隔10s，重復30 次）；
8000g 4℃離心 10min，取上清，置冰上待測。 
2、組織：按照組織質量（g） ：提取液體積(mL)為 1：5~10 的比例（建議稱取約 0.1g組織，
加入 1mL提取液），進行冰浴勻漿。8000g 4℃離心10min，取上清，置冰上待測。 
3、血清（漿）樣品：直接檢測。 
測定步驟 
1、 分光光度計預熱 30min以上，調節波長至 340nm，蒸餾水調零。 
2、 將試劑一、二、三、四和五 37℃(哺乳動物)或 25℃(其它物種)預熱10 分鐘。 
3、 加樣表： 
試劑名稱（μL）  測定管 
試劑一  400 
試劑二  400 
試劑三  80 
試劑四  80 
試劑五  40 
試劑六  8 
樣本  30 
將上述試劑按順序加入 1 mL石英比色皿中，立即混勻，加樣本的同時開始計時，在 340 nm
波長下記錄 20秒時的初始吸光度 A1和 5 分 20秒時的吸光度 A2，計算 ΔA=A2-A1。 注意事項 
1、如果一次性測定樣本數較多，可將試劑一、二、三、四、五和六按比例配成混合液，預
熱 10min。 
2、不同勻漿組織中 HK 活力不一樣，做正式試驗之前請做1-2只預試，若 ΔA>0.5，則說明
組織活力太高，必須用提取液稀釋成適當濃度勻漿上清液（計算公式中乘以相應稀釋倍數），
或縮短反應時間至 2min,使 ΔA<0.5，以提高檢測靈敏度。 
HK活性計算 
1、血清（漿）HK 活性 
單位的定義：每毫升血清（漿）在每分鐘生成 1 nmol 的 NADPH 定義為一個酶活力單位。 
HK（U/mL）＝[ΔA×V反總÷（ε×d）×109
]÷V樣÷T=1113×ΔA 
2、組織、細菌或細胞中HK 活性 
（1）按樣本蛋白濃度計算 
單位的定義：每 mg組織蛋白每分鐘生成1 nmol的 NADPH 定義為一個酶活力單位。 
HK（U/mg prot）＝[ΔA×V反總÷（ε×d）×109
]÷(V樣×Cpr) ÷T=1113×ΔA÷Cpr 
（2）按樣本鮮重計算 
單位的定義：每 g組織每分鐘生成 1 nmol的 NADPH 定義為一個酶活力單位。 
HK（U/g 鮮重）＝[ΔA×V反總÷（ε×d）×109
]÷(W ×V樣÷V樣總) ÷T=1113×ΔA÷W 
（3）按細菌或細胞密度計算 
單位的定義：每 1 萬個細菌或細胞每分鐘生成 1 nmol 的 NADPH 定義為一個酶活力單位。 
HK（U/104
 cell）＝[ΔA×V反總÷（ε×d）×109
]÷(500×V樣÷V樣總) ÷T=2.226×ΔA 
V反總：反應體系總體積，1.038×10-3
 L；ε：NADPH 摩爾消光系數，6.22×103
 L / mol /cm；
d：比色皿光徑，1cm；V樣：加入樣本體積，0.03 mL；V樣總：加入提取液體積，1 mL；
T：反應時間，5  min；Cpr：樣本蛋白質濃度，mg/mL；W：樣本質量，g；500：細菌或細
胞總數，500萬。