目的基因的PCR克隆

【資料簡介】

5.1實驗原理 
5.1.1聚合酶鏈式反應（PCR）的基本構成 
PCR指在引物指導下由酶催化的對特定模板（克隆或基因組DNA）的擴增反應，是模擬體內DNA復制過程，在體外特異性擴增DNA片段的一種技術，在分子生物學中有廣泛的應用，包括用于DNA作圖、DNA測序、分子系統遺傳學等。 
PCR基本原理是以單鏈DNA為模板，4種dNTP為底物，在模板3’末端有引物存在的情況下，用酶進行互補鏈的延伸，多次反復的循環能使微量的模板DNA得到程度的擴增。在微量離心管中，加入與待擴增的DNA片段兩端已知序列分別互補的兩個引物、適量的緩沖液、微量的DNA膜板、四種dNTP溶液、耐熱Taq dna聚合酶、Mg2+等。反應時先將上述溶液加熱，使模板DNA在高溫下變性，雙鏈解開為單鏈狀態；然后降低溶液溫度，使合成引物在低溫下與其靶序列配對，形成部分雙鏈，稱為退火；再將溫度升至合適溫度，在Taq DNA聚合酶的催化下，以dNTP為原料，引物沿5’→3’方向延伸，形成新的DNA片段，該片段又可作為下一輪反應的模板，如此重復改變溫度，由高溫變性、低溫復性和適溫延伸組成一個周期，反復循環，使目的基因得以迅速擴增。因此PCR循環過程為三部分構成：模板變性、引物退火、熱穩定DNA聚合酶在適當溫度下催化DNA鏈延伸合成。 
（1）模板DNA的變性 
模板DNA加熱到90~95℃時，雙螺旋結構的氫鍵斷裂，雙鏈解開成為單鏈，稱為DNA的變性。變性溫度與DNA中G-C含量有關，G-C間由三個氫鍵連接，而A-T間只有兩個氫鍵相連，所以G-C含量較高的模板，其解鏈溫度相對要高些。故PCR中DNA變性需要的溫度和時間與模板DNA的二級結構的復雜性、G-C含量高低等均有關。對于高G-C含量的模板DNA在實驗中需添加一定量二甲基亞砜（DMSO），并且在PCR循環中起始階段熱變性溫度可以采用97℃，時間適當延長，即所謂的熱啟動。 
（2）模板DNA與引物的退火 
將反應混合物溫度降低至37~65℃時，寡核苷酸引物與單鏈模板雜交，形成DNA模板-引物復合物。退火所需要的溫度和時間取決于引物與靶序列的同源性程度及寡核苷酸的堿基組成。一般要求引物的濃度大大高于模板DNA的濃度，并由于引物的長度顯著短于模板的長度，因此在退火時，引物與模板中的互補序列的配對速度比模板之間重新配對成雙鏈的速度要快得多，退火時間一般為1～2min。 
（3）引物的延伸 
DNA模板-引物復合物在Taq DNA聚合酶的作用下，以dNTP為反應原料，靶序列為模板，按堿基配對與半保留復制原理，合成一條與模板DNA鏈互補的新鏈。延伸所需要的時間取決于模板DNA的長度。在72℃條件下，Taq DNA聚合酶催化的合成速度大約為40～60個堿基/秒。經過一輪“變性-退火-延伸”循環，模板拷貝數增加了一倍。在以后的循環中，新合成的DNA都可以起模板作用，因此每一輪循環以后，DNA拷貝數就增加一倍。每完成一個循環需2～4min，一次PCR經過30～40次循環，約2～3h。擴增初期，擴增的量呈直線上升，但是當引物、模板、聚合酶達到一定比值時，酶的催化反應趨于飽和，便出現所謂的“平臺效應”，即靶DNA產物的濃度不再增加。 
5.1.2 PCR反應的五個元素 
參與PCR反應的物質主要為五種：引物、酶、dNTP、模板和Mg 2+ 。

5.1.2.1 引物 
引物是PCR特異性反應的關鍵，PCR產物的特異性取決于引物與模板DNA互補的程度。理論上，只要知道任何一段模板DNA序列，就能按其設計互補的寡核苷酸鏈做引物，利用PCR就可將模板DNA在體外大量擴增。 
引物設計應遵循以下原則： 
（1）引物長度 
長度要求在15～30bp，常用為20bp左右，引物過短時會造成Tm值過低，在酶反應溫度時不能與模板很好的配對；引物過長時又會造成Tm值過高，超過酶反應的zui適溫度，且合成長引物還會使費用大大增加。 
（2）引物堿基構成 
引物的G+C含量以40～60%為宜，因為G+C含量過高或過低都會直接造成Tm值的過高或過低，都不利PCR反應的進行。ATGC隨機分布，避免5個以上的嘌呤或嘧啶核苷酸的成串排列。 
（3）引物二級結構 
應盡量避免引物內部出現二級結構，并且兩條引物間不能形成互補結構，特別是3’端的互補，否則形成引物二聚體，PCR擴增中產生非特異的條帶。引物自身也應無回文對稱結構（限制性酶切位點除外），防止形成莖環結構。