要使ELISA試劑盒測定得到精確的成果，不論是定性的仍是定量的，必須嚴格按照規定的辦法制備試劑和施行測定。主要試劑的制備關鍵已如前述，其他一般性試劑，如包被緩沖液、洗刷液、標本稀釋液、結合物稀釋液、底物工作液和酶反響停止液等，制造時不行掉以輕心。
 

(一)加樣
在ELISA試劑盒中除了包被外，一般需進行45加樣。在定性測定中有時不強調加樣量的精確性，例如規定為加樣一滴。此刻應該運用相同口徑的滴管，保持精確的加樣姿勢，使每滴液體的體積基本相同。在定量測定中則加樣量應力求精確。標本和結合物的稀釋液應按規定制造。加樣時應將液體加在孔底，防止加在孔壁上部，并留意不行出現氣泡。
 

(二)比色
如陰性對照色彩極淺，在定性測定中一般可采用目視比色。如用比色計測定成果，精確性決議于ELISA板底的平坦與透明度和比色計的質量。
 

(三)洗刷
洗刷在ELISA試劑盒過程中不是反響聚，但卻是決議試驗成敗的關鍵。洗刷的意圖是洗去反響液中沒有與固相抗原或抗體結合的物質以及在反響過程中非特異性吸附于固相載體的攪擾物質。聚苯乙烯待塑料對蛋白質的吸附效果是普遍性的。因此在ELISA試劑盒測定的反響過程中應盡量防止非特異性吸附，而在洗刷時又應把這種非特異性吸附的攪擾物質洗刷下來。在標本和結合物的稀釋液和洗刷液中參加聚山梨酯一類物質即右達到此意圖。聚山梨酯是聚氧乙烯去水山梨醇脂肪酸酯，為非離子型的表面張力物質，常作為助溶劑。依據脂肪酸的品種而對聚山梨酯編號，結合月桂酸的為聚山梨酯20，在ELISA中zui為常用。它的洗刷效果好，并具有減少非特異性吸附和增強抗原抗體結合的效果。
 

洗刷如不*，特別在zui后一次，如有酶結合物的非特異性吸附，將使空白值升高。另外，在間接法中如血清標本內的非特異性IgG吸附在固相上而未被洗凈，也將與酶標抗體效果而產生攪擾。
ELISA板的洗刷一般可采用以下辦法：①吸干孔內反響液;②將洗刷液注滿板孔;③放置2min，略作搖擺;④吸干孔內液，也可傾去液體后在吸水紙上拍干。洗刷的次數一般為3～4次，有時甚至需洗5～6次。
 

(四)保溫
在ELISA試劑盒中一般有二次抗原抗體反響，即加標本后和加結合物后，此刻反響的溫度和時刻應按規定的要求，保溫容器是水浴箱，可使溫度迅速平衡。各ELISA板不該疊在一同。為防止蒸發，板上應加蓋，或將板平放在底部墊有濕紗布的濕盒中。濕盒應該是金屬的，傳熱容易。如用保溫箱，空濕盒應預先放在其中，以平衡溫度，這在室溫較低時更為重要。參加底物后，反響的時刻和溫度通常不做嚴格要求。如室溫高于20℃，ELISA板可避光放在試驗臺上，以便不時調查，待對照管顯色適其時，即可停止酶反響。