1．材料
① 免疫 血清60℃滅活20分鐘，用Kolmers鹽水作2倍稀釋成1:2、1:4、1:8或更高。如免疫血清補體結合的效價為1:32，則免疫血清應作1:8稀釋。Kolmers鹽水配制：在pH 7.4，0.1mol/L的磷酸緩沖鹽水中溶解MgSO4 ，含量為0.01%；
② 補體用新鮮豚鼠血清，一般作1:10稀釋或按補體結合反應試管法所測定的結果，按2單位的比例，用Kolmers鹽水稀釋備用；
③ 抗補體熒光抗體：在免疫血清效價為1:4，補體為2單位的條件下，用補體染色法測定免疫豚鼠球蛋白熒光抗體的染色效價，然后按染色效價1:4的濃度用Kolmers鹽水稀釋備用。
2．操作步驟
① 涂片或切片固定；
② 吸取經適當稀釋的免疫血清與補體等量混合液(此時免疫血清及補體均稀釋1倍)滴于切片上，置于濕盒內，37℃孵育30分鐘；
③ 用緩沖鹽水振蕩洗滌2次，每次5分鐘，吸干標本周圍水液；
④ 滴加經過適當稀釋的抗補體熒光抗體，37℃孵育30分鐘，水洗同上；
⑤ 蒸餾水洗1分鐘，甘油緩沖液封固。抗體
3．對照實驗染色過程應設立對照實驗，包括：
① 抗原對照；
② 抗血清對照：用正常兔血清代替免疫血清；
③ 滅活補體對照：將補體經56℃ 30分鐘處理后，按補體同樣比例稀釋，與免疫血清等量混合后，進行補體法染色。
此法的熒光抗體不受免疫血清的動物種屬限制，故一種熒光抗體的應用可更廣泛，敏感性亦較間接法高，效價低的免疫血清亦可應用，故可節省免疫血清，尤其是在檢查形態小的立克次體、病毒顆粒等或濃度較低的抗原時，使用此法甚為理想。
