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上海雅吉生物科技有限公司
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穩(wěn)定細(xì)胞株構(gòu)建
2021-1-6 閱讀(386)
穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞系（穩(wěn)定表達(dá)細(xì)胞株）指在細(xì)胞中持續(xù)穩(wěn)定表達(dá)特定基因或干擾特定基因表達(dá)。穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞株的目的基因質(zhì)粒DNA整合到細(xì)胞染色體上，使細(xì)胞長(zhǎng)期穩(wěn)定表達(dá)該基因。穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞株包括多克隆穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞株和單克隆穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞株。慢病毒感染目的細(xì)胞后，通過(guò)抗性基因篩選得到的細(xì)胞株是多個(gè)細(xì)胞克隆的組合。單克隆細(xì)胞株是從多克隆細(xì)胞中經(jīng)細(xì)胞克隆挑選得到的，由一個(gè)細(xì)胞擴(kuò)增得到的細(xì)胞株。單克隆細(xì)胞株性狀統(tǒng)一，傳代過(guò)程中細(xì)胞的基因表達(dá)保持穩(wěn)定。
用轉(zhuǎn)染質(zhì)?；虿《厩秩镜姆椒▽?gòu)建好的含靶基因的載體導(dǎo)入細(xì)胞，根據(jù)不同的基因載體中所含的抗性標(biāo)志選用相應(yīng)的藥物進(jìn)行篩選混合陽(yáng)性克隆。在陽(yáng)性混合克隆的基礎(chǔ)上，得到單細(xì)胞長(zhǎng)出的陽(yáng)性單克隆，繼而得到穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞株。常用的真核表達(dá)載體的抗性標(biāo)志物有嘌呤霉素（puromycin）、潮霉素（hygromycin）和新霉素（neomycin）。
篩選穩(wěn)定細(xì)胞株的兩種方法
1、轉(zhuǎn)染質(zhì)粒后，單克隆方法篩選穩(wěn)定細(xì)胞系
對(duì)大多數(shù)細(xì)胞轉(zhuǎn)染效率較低。對(duì)于基因過(guò)表達(dá)，如果轉(zhuǎn)染效率達(dá)到40%，基因過(guò)表達(dá)尚可。但是對(duì)于基因干擾實(shí)驗(yàn)，對(duì)轉(zhuǎn)染效率要求遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于基因過(guò)表達(dá)，通常質(zhì)粒轉(zhuǎn)染無(wú)法滿足。
另外，質(zhì)粒游離于細(xì)胞質(zhì)中，很快降解，無(wú)法滿足較長(zhǎng)時(shí)間的檢測(cè)項(xiàng)目；質(zhì)粒轉(zhuǎn)染整合幾率極低，穩(wěn)定細(xì)胞株構(gòu)建耗時(shí)耗力，且得率很低，往往需要挑取單克隆株。
2、病毒感染篩選穩(wěn)定細(xì)胞株
病毒感染方法較質(zhì)粒轉(zhuǎn)染篩選單克隆方法更方便和高效，是目前主流的穩(wěn)定細(xì)胞系篩選方法。用慢病毒制備穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞株，由于其高效整合、高效轉(zhuǎn)錄、高效表達(dá)、宿主范圍廣，感染效率高，且與細(xì)胞染色體整合而不發(fā)生基因重排，是制備穩(wěn)定細(xì)胞株的理想載體。
穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞株服務(wù)流程
1、載體構(gòu)建：將外源基因構(gòu)建到合適的載體上，如需病毒轉(zhuǎn)染，則包裝病毒。
2、篩選濃度測(cè)定：以 10-14 天細(xì)胞全部死亡的抗生素濃度為篩選濃度。
3、細(xì)胞接種：轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)前天接種細(xì)胞，各種細(xì)胞的平板密度依據(jù)各種細(xì)胞的生長(zhǎng)率和細(xì)胞形狀而定。進(jìn)行轉(zhuǎn)染當(dāng)天細(xì)胞應(yīng)達(dá)到 60%-80% 覆蓋。
4、細(xì)胞轉(zhuǎn)染：用構(gòu)建好的載體（或包裝好的病毒）轉(zhuǎn)染目的細(xì)胞。
5、抗生素篩選。
6、鑒定篩選結(jié)果。
