從天然V基因中制備噬菌體抗體文庫時，有多種不同B細胞（即V基因）來源可供選擇。一般而言，可在兩種V基因之間做出選擇：一種是未經歷體細胞突變的V基因[天然的且一般是免疫球蛋白M（1gM）]，一種是發生過此突變的V基因[免疫的且一般是免疫球蛋白G（IgG）]。自IgM演變為IgG過程中，存在著一個天然度的梯度變化。采用多樣性小于10‘天然文庫所做的早期試驗結果提示：IgM來源的V基因優于IgG來源的V基因。然而，用來自骨髓、外周血以及扁桃腺的未分部V基因組建了一個容量大很多的抗體文庫，從中分離到了針對許多抗原的抗體。對來自此文庫V基因進行的分析顯示：大多數所選擇到的結合抗原的V基因含有多個突變體；這提示它們或來自IgG，或來自突變的IgM區。其他大容量天然文庫無一例外地使用IgM來源的V基因。

來源于外周血、脾臟、扁桃腺和骨髓的淋巴細胞都可用來構建文庫。對它們的優劣勢還沒有系統性地研究，盡管可以預期來自慢性感染的組織（扁桃腺）所含V基因可能高度偏向于感染性致病原。無論采用何種來源的淋巴細胞，流程基本上都是一致的。

無需制備多聚腺苷酸RNA（poly A RNA）來合成cDNA，總RNA效果就已很好。構建免疫文庫應使用以IgG為基礎的引物，而天然文庫的制備采用IgM引物。另外有一種方法是，先用隨機六聚體引物引導RNA，接著再用特異性3’端引物分離IgM或IgG特異性V基因。

cDNA合成后，用特異性引物可從cDNA中擴增V區；這些引物可以識別重排V基因5’端和3’端相對保守的元件。