質粒dna的提取是DNA技術中的*實驗技能。質粒DNA上攜帶的基因信息可經過基因表達實驗后表現出相應的性狀。質粒DNA的分離提取包括了培養細胞——收集——分離純化三大步驟。

質粒是細胞內的一種環狀的小分子DNA，是進行DNA重組的常用載體。作為一個具有自身復制起點的復制單位獨立于細胞的主染色體之外，質粒dna上攜帶了部分的基因信息，經過基因表達后使其宿主細胞表現相應的性狀。在DNA重組中，質粒或經過改造后的質粒載體可通過連接外源基因構成重組體。

從宿主細胞中提取質粒DNA，是DNA重組技術中zui基礎的實驗技能。分離質粒DNA有三個步驟：

1、培養細菌使質粒擴增

2、收集和裂解細菌

3、分離和純化質粒DNA

堿裂解法是較常用的提取的方法。其優點是得率高，適合于大多數的和菌株，所得產物經純化后可滿足多數的DNA重組操作。此法采取酸堿度高達Ph12.6的堿溶液使DNA發生變性。由于質粒和主染色體的拓撲結構不同，變性時前者雖然兩條鏈分離，但仍然纏繞在一起不分開;而后者*變性分，甚至出現斷裂。因此，當加入中和液時，溶液Ph值恢復較低的近中性水平，此時， 質粒的兩條小分子單鏈可迅速復性，恢復雙鏈結構，但是主染色體DNA則無法復性。在離心時，大部分主染色體與細胞碎片，雜質等纏繞一起被沉淀，而可溶性的質粒DNA留在上清夜中。

在質粒提取過程中，由于機械力、酸堿度、試劑等的原因，可能使質粒DNA鏈發生斷裂。所以，多數質粒粗提取物中含有三種構型的質粒：

共價閉合環狀DNA（cccDNA）： 質粒的兩條鏈沒有斷裂;超螺旋

開環DNA（ocDNA）： 質粒的一條鏈斷裂;松弛的環狀分子

線形DNA（lDNA）： 質粒的兩條鏈均斷裂;線性分子

三、材料、試劑及器具

1、材料

E.coliDH 5α（pUC 19 vector）

2、試劑

1）LB培養基

2）TE緩沖液

3）裂解液：溶液Ⅰ、溶液Ⅱ、溶液Ⅲ

4）酚：氯仿：異戊醇（25：24：1）

5）無水乙醇

6）70%乙醇

7）氨芐50mg/mL

器具

離心機、離心管、吸嘴

四、操作步驟

以1%比例把E.coliDH5α（含PUC18）接種于含氨芐（Amp）100μg/ml）的LB培養基中37℃振搖過夜（12-18h）

↓

取1.5ml培養物置離心管中

↓

10000rpm,離心1min，或4000rpm，離心5-10min

↓

去上清，倒扣干凈吸收紙上吸干

↓

沉淀+100μL溶液Ⅰ

↓

加或不加入少量粉末;混勻，室溫放置10min

↓

+加200μL溶液Ⅱ（新鮮配置）

↓

溫和顛倒數次，混勻，冰上放置5min

↓

+150μl溶液Ⅲ→顛倒混勻，冰上放置15min

↓

離心12000rpm,15min

↓

上清液+等體積酚：氯仿：異戊醇振勻，12000rpm,離心5min

↓

小心轉移上層至一新的離心管棄下層有機相和中層蛋白質

↓

上清液+2倍體積無水乙醇混勻，室溫5min-10min

↓

12000rpm,5min-15min

↓棄上清

沉淀+1mL70%乙醇

↓

12000rpm離心5min-15min

↓

棄上清;并倒扣離心管使液體流干

↓+

自然干燥或真空抽干（看不到液滴為宜）

↓

加50μlTE緩沖液（20μg/mlRNaseA）溶解質粒粗取物

↓

-20℃保存

六、實驗報告

檢查、保存提取的質粒，要求記錄實驗現象并說明原因。

七、思考題

分析以下試劑的作用原理：

溶液Ⅰ：50mmol/L葡萄糖

5mmol/Ltris HCL （Ph 8.0）

10mmol/L EDTA（PH8.0）

溶液Ⅱ:0.4mol/L NaOH

2% SDS

使用前新鮮配制

溶液Ⅲ：5mol/L Kac 60 mL

冰醋酸11.5 mL

水28.5 mL

RNase A酶：將粉末溶于10mmol/L tris HCL （Ph7.5）、15mmol/L NACL中，配成10 mg/mL

濃度的酶液，于100℃水浴加熱15 min，緩慢冷卻至室溫，-20℃保存

氯仿

無水乙醇

附注：

1.溶液Ⅰ---溶菌液

：它是糖苷水解酶，能水解菌體細胞壁的主要化學成分肽聚糖中的β-1，4糖苷鍵，因而具有溶菌的作用。當溶液中PH小于8時，作用受到抑制。

葡萄糖：增加溶液的粘度，維持滲透壓，防止DNA受機械切力作用降解。

EDTA的作用：

（1）螯合Mg2+ 、Ca2+ 等金屬離子，抑制脫氧核酸酶對DNA的降解作用（DNase作用時一定的金屬離子作輔基）。

（2）EDTA的存在，有利于的作用，因為的反應要求有較低的離子強度的環境。

2.溶液Ⅱ--NaOH-SDS液：

NaOH：核酸在pH大于5，小于9的溶液中，是穩定的。但當pH>12或pH<3時，就會引起雙鏈之間氫鍵的解離而變性。在溶液Ⅱ中的NaOH濃度為0.2mol/L，加抽提液時，該系統的PH就高達12.6，因而促使染色體DNA與質粒DNA的變性。

SDS：SDS是離子型表面活性劑。它主要功能有：（1）溶解細胞膜上的脂質與蛋白，因而溶解膜蛋白而破壞細胞膜。（2）解聚細胞中的核蛋白。（3）SDS能與蛋白質結合成為R-O-SO3…R┿-蛋白質的復合物，使蛋白質變性而沉淀下來。但是SDS能抑制核糖核酸酶的作用，所以在以后的提取過程中，必須把它去除干凈，防止在下一步操作中（用RNase去除RNA時）受到干擾。

3.溶液Ⅲ--3MOL/L NaAc（pH4.8）溶液

NaAc的水溶液呈堿性，為了調節pH至4.8，必須加入大量的冰醋酸。所以該溶液實際上是NaAc-Hac的緩沖液。用PH4.8的NaAc溶液是為了反pH12.6的抽提液，調回PH至中性，使變性的質粒DNA能夠復性，并能穩定存在。而高鹽的3MOL/L NaAc有利于變性的大分子染色體DNA，RNA，以及SDS-蛋白復合物凝聚而沉淀之。前者是因為中和核酸上的電荷，減少相斥力而互相聚合，后者是因為鈉鹽與SDS-蛋白復合物作用后，能形成較小的鈉鹽形式復合物，使沉淀更*。

4.為什么用無水乙醇沉淀DNA?

用無水乙醇沉淀DNA，這是實驗中zui常用的沉淀DNA的方法。乙醇的優點是可以任意比和水相混溶，乙醇與核酸不會起任何化學反應，對DNA很安全，因此是理想的沉淀劑。

DNA溶液是DNA以水合狀態穩定存在，當加入乙醇時，乙醇會奪DNA周圍的水分子，使DNA失水而易于聚合。一般實驗中，是加2倍體積的無水乙醇與DNA相混合，其乙醇的zui終含量占67%左右。因而也可改用95%乙醇來替代懈水乙醇（因為無水乙醇的價格遠遠比95%乙醇昂貴）。但是加95%的乙醇使總體積增大，而DNA在溶液中有一定程度的溶解，因而DNA損失也增大，尤其用多次乙醇沉淀時，就會影響收得率。折中的做法初次沉淀DNA時可用95%乙醇代替無水乙醇，zui后的沉淀步驟要使用無水乙醇。也可以用0.6倍體積的異丙醇選擇性沉淀DNA。一般在室溫下放置15-30分鐘即可。

5.在用無水乙醇沉淀DNA時，為什么一定要加NaAC或NaCL至zui終濃度達0.1-0.25MOL/L?

在Ph為8左右的DNA溶液中，DNA分子是帶負電荷的，加一定濃度的NaAC或NaCL，使Na+中和DNA分子上的負電荷，減少DNA分子之間的同性電荷相斥力，易于互相聚合而形成DNA鈉鹽沉淀，當加入的鹽溶液濃度太低時，只有部分DNA形成DNA鈉鹽而聚合，這樣就造成DNA沉淀不*，當加入的鹽溶液濃度太高時，其效果也不好。在沉淀的DNA中，由于過多的鹽雜質存在，影響DNA的酶切等反應，必須要進行洗滌或重沉淀。

6.加核糖核酸酶降解核糖核酸后，為什么再要用SDS與Kac來處理?

加進去的Rnaese本身是一種蛋白質，為了純化DNA，又必須去除之，加SDS可使它們成為SDS-蛋白復合物沉淀，再加Kac使這些復合物轉變為溶解度更小的鉀鹽形式的SDS-蛋白質復合物，使沉淀更加*。也可用飽和酚，氯仿抽提再沉淀，去除Rnese。在溶液中，有人以Kac代替NaAc，也可以收到較好的效果。

7.為什么在保存或抽提DNA過程中，一般采用TE緩沖液?

在基因操作實驗中，選擇緩沖液的主要原則是考慮DNA的穩定性及緩沖液成分不產生干擾作用。磷酸鹽緩沖系統（pKa=7.2）和硼酸系統（pKa=9.24）等雖然也都符合細胞內環境的生理范圍，可作DNA的保存液，但在轉化實驗時，磷酸根離子的種類及數量將與Ca2 產生Ca3（PO4）2沉淀;在DNA反應時，不同的酶對輔助因子的種類及數量要求不同，有的要求高離子濃度，有的則要求低鹽濃度，采用Tris-HCL（pKa=8.0）的緩沖系統，由于緩沖液是TrisH /Tris，不存在金屬離子的干擾作用，故在提取或保存DNA時，大都采用Tris-HCL系統，而TE緩沖液中的EDTA更能穩定DNA的活性。

8.如何選擇聚乙二醇（6000）的濃度來沉淀DNA?

采用PEG（6000）沉淀DNA，大小不同的DNA分子所用的PEG的濃度也不同，PEG的濃度低，選擇性沉淀DNA分子量大，大分子所需PEG的濃度只需1%左右，小分子所需PEG濃度高達20%。本實驗選擇性沉淀4.3Kb的pBR322質粒DNA，每毫升加入0.4毫升的30%PEG，其zui終PEG濃度為12%。PEG選擇性沉淀DNA的分辯率大約100bp。

9.抽提DNA去除蛋白質時，怎樣使用酚與氯仿較好?

酚與氯仿是非極性分子，水是極性分子，當蛋白水溶液與酚或氯仿混合時，蛋白質分子之間的水分子就被酚或氯仿擠去使蛋白失去水合狀態而變性。經過離心，變性蛋白質的密度比水的密度為大，因而與水相分離，沉淀在水相下面，從而與溶解在水相中的DNA分開。而酚與氯仿有機溶劑比重更大，保留在zui下層。

作為表面變性的酚與氯仿，在去除蛋白質的作用中，各有利弊，酚的變性作用大，但酚與水想有一定程度的互溶，大約10%~15%的水溶解在酚相中，因而損失了這部分水相中的DNA，而氯仿的變性作用不如酚效果好，但氯仿與水不相混溶，不會帶走DNA。所以在抽提過程中，混合使用酚與氯仿效果。經酚*次抽提后的水相中有殘留的酚，由于酚與氯仿是互溶的，可用氯仿第二次變性蛋白質，此時一起將酚帶走。也可以在第二次抽提時，將酚與氯仿混合（1：1）使用。

10.為什么用酚與氯仿抽提DNA時，還要加少量的異戌醇?

在抽提DNA時，為了混合均勻，必須劇烈振蕩容光煥發器數次，這時在混合液內易產生氣泡，氣泡會阻止相互間的充分作用。加入異戌醇能降低分子表面張力，所以能減少抽提過程中的泡沫產生。一般采用氯仿與異戌醇為24：1之比。也可以采用酚，氯仿與異戌醇之比為25：24：1（不必先配制，可在臨用前把一份酚加入一份24：1的氯仿互異戌醇即成，）節同時異戌醇有助于分相，使離必后的上層水相，中層變性蛋白相以及下層有機溶劑相維持穩定。

11.為什么要用pH8的Tris水溶液飽和酚?呈粉紅色的酚可否使用?如何保存酚不被空氣氧化?

因為酚與水有一定的互溶。用水飽和的目的是使其抽提DNA過程中，不致吸收樣品中含有DNA的水分，減少DNA的損失。用Tris調節至PH為8是因為DNA在此條件下比較穩定。在中性或堿性條件下（PH5~7），RNA比DNA更容易游離到水相，所以可獲得RNA含量較少的DNA樣品。

保存在冰箱中的酚，容易被空氣氧公而變成粉紅色的，這樣的酚容易降解DNA，一般不可以使用。為了防止酚的氧化，可加入巰基乙醇和8-羥基喹啉至終濃度為0.1%。8-羥基喹啉是帶有淡黃色的固體粉末，不僅能抗氧化，并在一定程度上能抑制Dnase的活性，它是金屬離子的弱螯合劑。用Tris PH8.0水溶液飽和后的酚，分裝在棕色小試劑瓶里，上面蓋一層Tris水溶液或TE緩沖液，隔絕空氣，以裝滿蓋緊蓋子這宜，如有可能，可充氮氣，防止與空氣接觸而被氧化。平時保存在4℃或-20℃冰箱中，使用時，打開蓋子吸取后迅速加蓋，這樣可使酚不變質，可用數月。

堿裂解法是zui常用的質粒DNA提取方法。此實驗過程中所涉及到的試劑都大有學問：例如TE緩沖液有利質粒DNA性狀穩定，無水乙醇不與核酸發生反應，是保存DNA*試劑等等。想了解更多請看上面的11個問題。