1.溶液I―溶菌液:
:它是糖苷水解酶,能水解菌體細(xì)胞壁的主要化學(xué)成分肽聚糖中的β-1,4糖苷鍵,因而具有溶菌的作用。當(dāng)溶液中pH小于8時(shí),作用受到抑制。
葡萄糖:增加溶液的粘度,維持滲透壓,防止DNA 受機(jī)械剪切力作用而降解。
EDTA:(1)螯合Mg2+、Ca2+等金屬離子,抑制脫氧核糖核酸酶對(duì)DNA 的降解作用(DNase作用時(shí)需要一定的金屬離子作輔基);(2)EDTA的存在,有利于的作用,因?yàn)榈姆磻?yīng)要求有較低的離子強(qiáng)度的環(huán)境。
2.溶液II-NaOH-SDS液:
NaOH:核酸在pH大于5,小于9的溶液中,是穩(wěn)定的。但當(dāng)pH>12或pH<3時(shí),就會(huì)引起雙鏈之間氫鍵的解離而變性。在溶液II中的NaOH濃度為0.2mo1/L,加抽提液時(shí),該系統(tǒng)的pH就高達(dá)12.6,因而促使染色體DNA 與質(zhì)粒dna 的變性。
SDS:SDS是離子型表面活性劑。它主要功能有:(1)溶解細(xì)胞膜上的脂質(zhì)與蛋白,因而溶解膜蛋白而破壞細(xì)胞膜。(2)解聚細(xì)胞中的核蛋白。(3)SDS能與蛋白質(zhì)結(jié)合成為R-O-SO3-…R+-蛋白質(zhì)的復(fù)合物,使蛋白質(zhì)變性而沉淀下來。但是SDS能抑制核糖核酸酶的作用,所以在以后的提取過程中,必須把它去除干凈,防止在下一步操作中(用RNase去除RNA 時(shí))受到干擾。
3.溶液III--3mol/L NaAc(pH4.8)溶液:
NaAc的水溶液呈堿性,為了調(diào)節(jié)pH至4.8,必須加入大量的冰醋酸。所以該溶液實(shí)際上是NaAc-HAc的緩沖液。用pH4.8的NaAc溶液是為了把pH12.6的抽提液,調(diào)回pH至中性,使變性的質(zhì)粒DNA 能夠復(fù)性,并能穩(wěn)定存在。而高鹽的3mol/L NaAc有利于變性的大分子染色體DNA 、RNA 以及SDS-蛋白復(fù)合物凝聚而沉淀之。前者是因?yàn)橹泻秃怂嵘系碾姾?減少相斥力而互相聚合,后者是因?yàn)殁c鹽與SDS-蛋白復(fù)合物作用后,能形成較小的鈉鹽形式復(fù)合物,使沉淀更*。
4.為什么用無水乙醇沉淀DNA ?
用無水乙醇沉淀DNA ,這是實(shí)驗(yàn)中zui常用的沉淀DNA 的方法。乙醇的優(yōu)點(diǎn)是可以任意比和水相混溶,乙醇與核酸不會(huì)起任何化學(xué)反應(yīng),對(duì)DNA 很安全,因此是理想的沉淀劑。
DNA 溶液是DNA 以水合狀態(tài)穩(wěn)定存在,當(dāng)加入乙醇時(shí),乙醇會(huì)奪去DNA 周圍的水分子,使DNA 失水而易于聚合。一般實(shí)驗(yàn)中,是加2倍體積的無水乙醇與DNA 相混合,其乙醇的zui終含量占67%左右。因而也可改用95%乙醇來替代無水乙醇(因?yàn)闊o水乙醇的價(jià)格遠(yuǎn)遠(yuǎn)比95%乙醇昂貴)。但是加95%的乙醇使總體積增大,而DNA 在溶液中有一定程度的溶解,因而DNA 損失也增大,尤其用多次乙醇沉淀時(shí),就會(huì)影響收得率。折中的做法是初次沉淀DNA 時(shí)可用95%乙醇代替無水乙酵,zui后的沉淀步驟要使用無水乙醇。也可以用0.6倍體積的異丙醇選擇性沉淀DNA 。一般在室溫下放置15-30分鐘即可。
5.在用乙醇沉淀DNA 時(shí),為什么一定要加NaAc或NaCl至zui終濃度達(dá)0.1~0.25mol/L?
在pH為8左右的溶液中,DNA 分子是帶負(fù)電荷的,加一定濃度的NaAc或NaCl,使Na+中和DNA 分子上的負(fù)電荷,減少DNA 分子之間的同性電荷相斥力,易于互相聚合而形成DNA 鈉鹽沉淀,當(dāng)加入的鹽溶液濃度太低時(shí),只有部分DNA 形成DNA 鈉鹽而聚合,這樣就造成DNA 沉淀不*,當(dāng)加入的鹽溶液濃度太高時(shí),其效果也不好。在沉淀的DNA 中,由于過多的鹽雜質(zhì)存在,影響DNA 的酶切等反應(yīng),必須要進(jìn)行洗滌或重沉淀。
6.加核糖核酸酶降解核糖核酸后,為什么再要用SDS與KAc來處理?
加進(jìn)去的RNase本身是一種蛋白質(zhì),為了純化DNA ,又必須去除之,加SDS可使它們成為SDS-蛋白復(fù)合物沉淀,再加KAc使這些復(fù)合物轉(zhuǎn)變?yōu)槿芙舛雀〉拟淃}形式的SDS-蛋白質(zhì)復(fù)合物,使沉淀更加*。也可用飽和酚、氯仿抽提再沉淀,去除RNase。在溶液中,有人以KAc代替NaAc,也可以收到較好效果。
7.為什么在保存或抽提DNA 過程中,一般采用TE緩沖液?
在基因操作實(shí)驗(yàn)中,選擇緩沖液的主要原則是考慮DNA 的穩(wěn)定性及緩沖液成分不產(chǎn)生干擾作用。磷酸鹽緩沖系統(tǒng)(pKa=7.2)和硼酸系統(tǒng)(pKa=9.24)等雖然也都符合細(xì)胞內(nèi)環(huán)境的生理范圍(pH),可作DNA 的保存液,但在轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)時(shí),磷酸根離子的種類及數(shù)量將與Ca2+產(chǎn)生Ca3(PO4)2沉淀;在DNA 反應(yīng)時(shí),不同的酶對(duì)輔助因子的種類及數(shù)量要求不同,有的要求高離子濃度,有的則要求低鹽濃度,采用Tris-HCl(pKa=8.0)的緩沖系統(tǒng),由于緩沖液是TrisH+/Tris,不存在金屬離子的干擾作用,故在提取或保存DNA 時(shí),大都采用Tris-HCl系統(tǒng),而TE緩沖液中的EDTA更能穩(wěn)定DNA 的活性。
8.如何選擇聚乙二醇(6000)的濃度來沉淀DNA ?
采用PEG(6000)沉淀DNA ,大小不同的DNA 分子所用的PEG的濃度也不同,PEG的濃度低,選擇性沉淀DNA 分子量大,大分子所需PEG的濃度只需1%左右,小分子所需PEG濃度高達(dá)20%。本實(shí)驗(yàn)選擇性沉淀4.3kb的pBR322質(zhì)粒DNA ,每毫升加入0.4毫升的30% PEG,其zui終PEG濃度為12%。PEG選擇性沉淀DNA 的分辨率大約100bp。