細胞原代培養

時間：2014-10-9閱讀：786

一、原理

將動物機體的各種組織從機體中取出，經各種酶（常用）、螯合劑（常用EDTA）或機械方法處理，分散成單細胞，置合適的培養基中培養，使細胞得以生存、生長和繁殖，這一過程稱原代培養。

二、儀器、材料及試劑

儀器：培養箱（調整至37℃），培養瓶、瓶、小玻璃漏斗、平皿、吸管、移液管、紗布、手術器械、血球計數板、離心機、水浴箱（37℃）

材料：胎鼠或新生鼠

試劑：1640培養基（含20%小牛血清），0.25%，Hank’s液，碘酒

三、操作步驟

（一）消化法

1、器材：將孕鼠或新生小鼠拉頸椎致死，置75%酒精泡2—3秒鐘（時間不能過長、以免酒精從口和肛門浸入體內），再用碘酒消毒腹部，取胎鼠帶入超凈臺內（或將新生小鼠在超凈臺內）解剖取肝臟，置平皿中。

2、用Hank’s液洗滌三次，并剔除脂肪，結締組織，血液等雜物。

3、用將肝臟剪成小塊（1mm2），再用Hank’s液洗三次，轉移至小瓶中。

4、視組織塊量加入5—6倍的0.25%液，37℃中消化20—40分鐘，每隔5分鐘振蕩一次，或用吸管吹打一次，使細胞分離。

5、加入3—5ml培養液以終止消化作用（或加入抑制劑）。

6、靜置5—10分鐘，使未分散的組織塊下沉，取懸液加入到離心管中。

7、1000rpm，離心10分鐘，棄上清液。

8、加入Hank’s液5ml，沖散細胞，再離心一次，棄上清液。

9、加入培養液l—2 ml（視細胞量），血球計數板計數。

10、將細胞調整到5×105/ml左右，轉移至25ml細胞培養瓶中，37℃下培養。

上述消化分離的方法是zui基本的方法，在該方法的基礎上，可進一步分離不同細胞。細胞分離的方法各實驗室不同，所采用的消化酶也不相同（如膠原酶，透明質酶等）。

（二）組織塊直接培養法

自上方法第3步后，將組織塊轉移到培養瓶，貼附與瓶底面。翻轉瓶底朝上，將培養液加至瓶中，培養液勿接觸組織塊。入37℃靜置3—5小時，輕輕翻轉培養瓶，使組織浸入培養液中（勿使組織漂起），37℃繼續培養。

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