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蛋白質組學及研究技術路線

時間:2015-3-17閱讀:661
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基因組(genome)包含的遺傳信息經轉錄產生mRNA,一個細胞在特定生理或病理狀態下表達的所有種類的mRNA稱為轉錄子組(transcriptome)。很顯然,不同細胞在不同生理或病理狀態下轉錄子組包含的mRNA的種類不盡相同。mRNA經翻譯產生蛋白質,一個細胞在特定生理或病理狀態下表達的所有種類的蛋白質稱為蛋白質組(proteome)。同理,不同細胞在不同生理或病理狀態下所表達的蛋白質的種類也不盡相同。蛋白質是基因功能的實施者,因此對蛋白質結構,定位和蛋白質-蛋白質相互作用的研究將為闡明生命現象的本質提供直接的基礎。

生命科學是實驗科學,因此生命科學的發展地依賴于實驗技術的發展。以DNA序列分析技術為核心的基因組研究技術推動了基因組研究的日新月異,而以基因芯片技術為代表的基因表達研究技術為科學家了解基因表達規律立下汗馬功勞。在蛋白質組研究中,二維電泳和質譜技術的黃金組合又為科學家掌握蛋白質表達規律再鑄輝煌。蛋白質組學(proteomics)就是指研究蛋白質組的技術及這些研究得到的結果。

蛋白質組學的研究試圖比較細胞在不同生理或病理條件下蛋白質表達的異同,對相關蛋白質進行分類和鑒定。更重要的是蛋白質組學的研究要分析蛋白質間相互作用和蛋白質的功能。

蛋白質組學的研究內容包括:

1.蛋白質鑒定:可以利用一維電泳和二維電泳并結合Western等技術,利用蛋白質芯片和抗體芯片及免疫共沉淀等技術對蛋白質進行鑒定研究。

2.翻譯后修飾:很多mRNA表達產生的蛋白質要經歷翻譯后修飾如磷酸化,糖基化,酶原激活等。翻譯后修飾是蛋白質調節功能的重要方式,因此對蛋白質翻譯后修飾的研究對闡明蛋白質的功能具有重要作用。

3.蛋白質功能確定:如分析酶活性和確定酶底物,細胞因子的生物分析/配基-受體結合分析。可以利用基因敲除和反義技術分析基因表達產物-蛋白質的功能。另外對蛋白質表達出來后在細胞內的定位研究也在一定程度上有助于蛋白質功能的了解。Clontech的熒光蛋白表達系統就是研究蛋白質在細胞內定位的一個很好的工具。

4.對人類而言,蛋白質組學的研究zui終要服務于人類的健康,主要指促進分子醫學的發展。如尋找藥物的靶分子。很多藥物本身就是蛋白質,而很多藥物的靶分子也是蛋白質。藥物也可以干預蛋白質-蛋白質相互作用。

在基礎醫學和疾病機理研究中,了解人不同發育、生和不同生理、病理條件下及不同細胞類型的基因表達的特點具有特別重要的意義。這些研究可能找到直接與特定生理或病理狀態相關的分子,進一步為設計作用于特定靶分子的藥物奠定基礎。

不同發育、生和不同生理、病理條件下不同的細胞類型的基因表達是不一致的,因此對蛋白質表達的研究應該到細胞甚至亞細胞水平。可以利用免疫組織化學技術達到這個目的,但該技術的致命缺點是通量低。LCM技術可以地從組織切片中取出研究者感興趣的細胞類型,因此LCM技術實際上是一種原位技術。取出的細胞用于蛋白質樣品的制備,結合抗體芯片或二維電泳-質譜的技術路線,可以對蛋白質的表達進行原位的高通量的研究。很多研究采用勻漿組織制備蛋白質樣品的技術路線,其研究結論值得懷疑,因為組織勻漿后不同細胞類型的蛋白質混雜在一起,zui后得到的研究數據根本無法解釋蛋白質在每類細胞中的表達情況。雖然培養細胞可以得到單一類型細胞,但體外培養的細胞很難模擬體內細胞的環境,因此這樣研究得出的結論也很難用于解釋在體實際情況。因此在研究中首先應該將不同細胞類型分離,分離出來的不同類型細胞可以用于基因表達研究,包括mRNA和蛋白質的表達。LCM技術獲得的細胞可以用于蛋白質樣品的制備。可以根據需要制備總蛋白,或膜蛋白,或核蛋白等,也可以富集糖蛋白,或通過去除白蛋白來減少蛋白質類型的復雜程度。相關試劑盒均有廠商提供。

蛋白質樣品中的不同類型的蛋白質可以通過二維電泳進行分離。二維電泳可以將不同種類的蛋白質按照等電點和分子量差異進行高分辨率的分離。成功的二維電泳可以將2000到3000種蛋白質進行分離。電泳后對膠進行高靈敏度的染色如銀染和熒光染色。如果是比較兩種樣品之間蛋白質表達的異同,可以在同樣條件下分別制備二者的蛋白質樣品,然后在同樣條件下進行二維電泳,染色后比較兩塊膠。也可以將二者的蛋白質樣品分別用不同的熒光染料標記,然后兩種蛋白質樣品在一塊膠上進行二維電泳的分離,zui后通過熒光掃描技術分析結果。

膠染色后可以利用凝膠圖象分析系統成像,然后通過分析軟件對蛋白質點進行定量分析,并且對感興趣的蛋白質點進行定位。通過專門的蛋白質點切割系統,可以將蛋白質點所在的膠區域進行切割。接著對膠中蛋白質進行酶切消化,酶切后的消化物經脫鹽/濃縮處理后就可以通過點樣系統將蛋白質點樣到特定的材料的表面(MALDI-TOF)。zui后這些蛋白質就可以在質譜系統中進行分析,從而得到蛋白質的定性數據;這些數據可以用于構建數據庫或和已有的數據庫進行比較分析。實際上像人類的血漿,尿液,腦脊液,乳腺,心臟,膀胱癌和磷狀細胞癌及多種病原微生物的蛋白質樣品的二維電泳數據庫已經建立起來,研究者可以登錄www.expasy.ch/www/tools.html等進行查詢,并和自己的同類研究進行對比分析。

Genomic Solution可以為研究者提供除質譜外的所有蛋白質組學研究工具,包括二維電泳系統,成像系統及分析軟件,膠切割系統,蛋白質消化濃縮工作站,點樣工作站等;同時還可以提供相關試劑和消耗品。

LCM-二維電泳-質譜的技術路線是典型的一條蛋白質組學研究的技術路線,除此以外,LCM-抗體芯片也是一條重要的蛋白質組學研究的技術路線。即通過LCM技術獲得感興趣的細胞類型,制備細胞蛋白質樣品,蛋白質經熒光染料標記后和抗體芯片雜交,從而可以比較兩種樣品蛋白質表達的異同。Clontechzui近開發了一張抗體芯片,可以對378種膜蛋白和胞漿蛋白進行分析。該芯片同時配合了抗體芯片的全部操作過程的重要試劑,包括蛋白質制備試劑,蛋白質的熒光染料標記試劑,標記體系的純化試劑,雜交試劑等。

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