SPA的純化

時間：2015-4-14閱讀：721

1.DEAE-Sephadex A-25離子交換層析法

⑴ 用0.1mol/L NH₄HCO₃緩沖液平衡DEAE-Sephadex A-25柱。
　　⑵ 加樣后，用0.1mol/L NH₄HCO₃緩沖液洗脫12h~14h。
　　⑶ 改用0.4mol/L NH₄HCO₃緩沖液洗脫，流速0.15ml~0.2ml/min，收集流出液，測OD275nm。
　　⑷ 測SPA活性（以對流免疫電泳），能與人及豬正常血清產生沉淀線的各管合并。
　　⑸ 濃縮或凍干保存。

2.Sphadex G100凝膠過柱法

裝柱、加樣，以0.05mol/L pH7.4 PBS洗脫，收集洗脫液，如上法測定活性和蛋白含量。

3.親和層析法

(1)豬IgG的制備：取正常豬血清，硫酸銨提取球蛋白，再過DEAE-纖維素-32柱，制得純化的IgG，以0.1mol/L NaHCO₃液平衡，配成4mg~5mg/ml溶液。
　　(2)偶聯：將固體溴化氰1.2g溶于20ml蒸餾水中，傾入容積為15ml的Sepharose-4B中，攪拌，同時滴加2mol/L NaOH使pH維持在11.0，反應8min，用500ml預冷的0.1mol/L NaHCO₃在2號砂芯漏斗上洗脫已活化的Sepharose-4B（在90Sec內洗脫完畢），迅速加入IgG液15ml，于4℃緩慢攪拌過夜，次日以PBS充分洗滌，至洗出液OD280nm<0.02為止。加入30ml 1.0mol/L乙醇胺洗柱，以封閉殘余活性基團，再以PBS洗至中性為止。
　　(3)PBS親和層析：將粗制SPA溶于PBS液中，加入IgG-Sepharose-4B柱，流速0.2ml/min，以PBS洗至OD280nm<0.02為止，換用0.1mol/L pH2.3-鹽酸緩沖液洗脫，流速0.2ml/min，收集洗脫液，即為純化的SPA，對流電泳檢查SPA活性，收集，濃縮，保存。

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